ITC 等温滴定量热法
直接测量分子结合过程中的热量变化，无需标记也无需固定，一次实验同时得到亲和力与完整热力学参数。
技术概览
等温滴定量热法是表征分子间亲和力的基本工具之一。
等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）通过测量分子在天然条件下滴定过程中的热量变化来表征分子间亲和力，是研究靶点与配体 / 候选药物相互作用的基本工具之一。
与荧光或光学类方法不同，ITC 既不需要标记，也不需要把分子固定到固相表面：两个分子都自由地处在溶液中，结合或解离时吸收、放出的热量被直接记录下来。因此它给出的不是相对信号，而是一套完整的热力学参数。
原理简介
两个分子都自由地处在溶液中，结合时吸收或放出的热量被直接记录下来。
实验时，一种分子装在样品池中，另一种装在滴定针里，按设定体积逐次注入。每次注入都会因结合而放热或吸热，仪器通过功率补偿维持样品池与参比池温度一致，补偿功率对时间积分即为该次注射的热量。
把每次注射的热量对摩尔比作图，得到一条随结合位点逐渐饱和而下降的滴定曲线；对这条曲线拟合即可同时得到结合常数 KD、结合焓 ΔH 与化学计量比 N，再由热力学关系推导出自由能变化 ΔG 与熵变 ΔS。
一次实验可得到的参数
| 参数 | 含义 | 说明 |
|---|---|---|
| KD | 解离常数（亲和力） | 常规直接滴定可测 10⁻⁴ ~ 10⁻⁹ M，配合竞争置换可拓展至 10⁻² ~ 10⁻¹² M |
| ΔH | 结合焓 | 由滴定曲线直接拟合得到，反映结合过程中键的形成与断裂 |
| ΔS | 结合熵 | 由 ΔG 与 ΔH 推导，反映疏水作用与构象变化的贡献 |
| N | 化学计量比 | 结合位点的数目，可从曲线拐点直接读出 |
| ΔG | 自由能变化 | 由 KD 推导，用于判断结合是否自发进行 |
热力学关系
ΔG = ΔH − TΔS自由能变化由焓变与熵变共同决定，据此可区分「焓驱动」与「熵驱动」的结合ΔG = RT · ln KD由解离常数直接换算自由能变化（KD 以 M 为单位、相对标准态）c = [P] / KDWiseman 参数，见下一节：决定这次滴定能不能拟合出可靠的 KD特点
- 免标记免固定分子保持天然构象，不需要荧光标签或芯片偶联
- 一次给全套参数单次滴定同时得到 KD、ΔH、ΔS 与化学计量比 N
- 溶液原位在接近生理条件的缓冲体系中测量，结果更接近真实体系
- 不受分子量限制小到离子、大到复合物均可，只看有没有热量变化
- 能量学解释可区分结合是焓驱动还是熵驱动，为结构优化提供方向
- 可扩展范围竞争置换滴定把可测亲和力拓宽到 10⁻² ~ 10⁻¹² M
c 值：浓度该怎么选
c 值（Wiseman 参数）直接反映一次直接滴定能不能拟合出可靠的 KD。
c 值（又称 Wiseman 参数）是 ITC 实验中的核心无量纲参数：直接滴定实验中，它等于滴定池中分子的摩尔浓度除以两分子之间的亲和力常数。
c 值直接反映一次结合实验的可检测性 —— 样品浓度选得不合适，滴定曲线要么平坦到看不出拐点，要么陡成一条竖线，两种情况都拟合不出可靠的 KD。
c = [P] / KD滴定池中分子的摩尔浓度除以两分子间的亲和力常数
竞争置换滴定：拓宽可测范围
超强或超弱的结合，用直接滴定都测不准，竞争置换提供了另一条路。
对于超强结合（KD < 10⁻⁹ M），若把样品浓度降到极低水平，热信号会低于仪器检测限 —— 除非该相互作用伴随异常大的焓变。竞争置换滴定量热法（displacement titration calorimetry）提供了解决思路：先让较弱亲和力的竞争配体 B 预结合到靶点上，再用强结合配体 A 滴定，A 逐步把 B 置换下来，通过热信号变化反推 A 的结合参数。
类似的竞争性置换策略也可用于低亲和力相互作用的测定，从而把 ITC 的检测范围从常规的 10⁻⁴ ~ 10⁻⁹ M 显著扩展到 10⁻² ~ 10⁻¹² M。
调控策略
- 提高弱配体 B 的浓度 [B]，提高分母值，从而降低表观 c 值。
- 选择中等亲和力的弱配体（KD,B 起码比 KD,A 大 10 倍），避免 [B]/KB << 1，否则置换效率降低。
- 滴定强配体 A 到缓冲液中做一次稀释热空白，用于数据拟合时扣除背景信号。
本节技术要点参考清华大学大型仪器共享服务平台关于 ITC 的技术分享。
应用领域
ITC 与 SPR、MST 互补：前者给出完整的能量学解释，后两者擅长实时监测动力学。
ITC 常用于药物靶点与候选分子的亲和力评价与排序、蛋白-蛋白与蛋白-核酸相互作用、酶与底物 / 抑制剂的动力学与热力学分析，以及脂质体、膜蛋白等较难体系的结合研究。
在完整的研究链条里，ITC 与 SPR、MST 是互补关系：SPR 与 MST 擅长实时监测结合动力学、且样品消耗极低；ITC 的优势在于一次实验给出完整的热力学图谱，解释「为什么结合得上」。
送样前需要确认
浓度、体积与缓冲液细节在方案确认后随正式送样表提供；涉及安全的信息请提前告知。
- 样品名称、浓度（μM / mM）、体积（μL）、缓冲液组成（含 pH）、纯度与聚集状态等明细，在方案确认后随正式送样表提供即可。
- 样品池与滴定针两侧的缓冲液尽量保持一致，否则稀释热会掩盖结合信号。
- 若样品含毒性 / 致病性 / 放射性成分、含还原剂（DTT / TCEP / BME）或存在沉淀、悬浮、色度，请在询价时一并告知，便于提前安排操作与防护。
相关服务
分子互作检测可以按需求组合：动力学、热力学与通量各有侧重。